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本制品是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测立克次氏体的试剂盒。


立克次氏体(Rickettsia spp.)是一类严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，有3个属，10个种，其中的Rickettsia prowazekii(普氏立克次氏体)、Rickettsia mooseri(现名Rickettsia typhi，莫氏立克次体)和Orientia tsutsugamushi(恙虫病东方体)等种可导致人类流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、恙虫病、Q热、斑点热等传染病，因此快速检测立克次氏体具有重要意义。

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
   
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
   
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
   
4. 特异性高，引物是根据立克次氏体DNA高度保守区设计，不会跟其他细菌的DNA发生交叉反应。
   
5. 涵盖性广，尤其是能检查危害人类健康的几种立克次氏体。
   
6. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
   
7. 本制品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
   
8. 本制品只能用于科研。

1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
   
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
   
3. 在6号管中加入5μL1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在5号管中加入5μL1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
5. 换枪头，在4号管中加入5μL1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。
   
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
   
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
    

    成分	样品管 N+2个	RT-PCR 阴性对照	标曲样品管 (1-6)
    2×Probe qPCR MagicMix	各10μL	10μL	各10μL
    立克次氏体qPCR引物-探针混合液	各3μL	3μL	各3μL
    超纯水	不加	7μL	不加
    第6步所得标准曲线样品稀释液(1～6号)	不加	不加	各7μL

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
    

    过程	温度	时间
    预变性	95℃	5min
    PCR反应 (45个循环)	95℃	15sec
    	60℃	1min(采集FAM通道，淬灭基团为TAMRA)

12. 如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
    
13. 如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
    
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，分别以阳性对照(FAM通道)和(HEX通道)的Ct值为纵轴，绘制标准曲线，阳性对照的标准曲线为斜线，r2必须大于0.95。再以待测样品的Ct值从阳性对照的标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
    
15. 对定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照FAM通道的Ct必须大于或等于40。阳性对照FAM通道的荧光信号必须有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40则为立克次氏体阴性，如果小于或等于35则为立克次氏体阳性。如果在35～40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。